PhD. Liane Portuondo-Farías^I, PhD. Dariellys Martínez-Balmori^I, PhD. Fernando Guridi-Izquierdo^I, PhD. Andrés Calderín-García^II, PhD. João Paulo Machado-Torres^III

^I Universidad Agraria de La Habana, Facultad de Agronomía, Departamento de Química, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

^II Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Laboratório de Solos, Rio de Janeiro, Brasil.

^III Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Laboratório de Radioisótopos. IBCCF-CCS, Rio de Janeiro, Brasil.

RESUMO

Existem plantas que tem a capacidade de tolerar condições de estresse por metais tóxicos, desenvolvendo mecanismos que permitem manter a homeostase. Objetivou-se com o presente trabalho verificar a partir da adição de ácidos húmicos - como possíveis estimuladores destes mecanismos - a atividade das enzimas fenilalanina-amonio-liase, nitrato reductase, conteúdo de nitratos totais e prolina, como componentes tanto do sistema de defensa antioxidante de plantas de feijão como do nitrogênio, submetidas a estresse por Pb²⁺. Sementes de feijão foram semeadas num solo Ferralítico vermelho típico contaminado artificialmente com 100 mg kg^-1 de Pb²⁺. Após 15 dias de germinadas, as plantas foram tratadas com soluções de ácidos húmicos nas concentrações de 20, 40 e 60 mg L^-1 mediante aspersão foliar na folha primária e na primeira folha trifoliolada e a cada 15 dias foram analisadas a atividade das enzimas. Os resultados evidenciaram uma atenuação dos efeitos bioquímico-fisiológicos causados pelo Pb²⁺ nos sistemas enzimáticos das plantas tratadas com ácidos húmicos, concluindo que os mesmos podem amenizar o estresse provocado pelo metal nas fases fenológicas avaliadas no cultivo do feijão, sendo a dose de 40 mg L^-1 a mais promissória.

Palavras chave: sustâncias húmicas, estresse oxidativo, mecanismos de defesa.

ABSTRACT

There are plants with the capacity to tolerate stress conditions due to toxic metals by developing mechanisms that allow them to maintain homeostasis. The purpose of this paper was to verify, after the addition of humid acids, as possible stimulators of these mechanisms, the activity of phenylalanine-ammonium-liase and nitrate reductase enzymes, content of total nitrate, proline, (as components both of the antioxidant system of bean) as well as nitrogen, in plants subjected to stress by Pb²⁺. Bean seeds were planted in a typical red Ferrallitic soil, artificially contaminated with 100 mg kg^-1 of Pb²⁺. Fifteen days after germination, the plants were treated with humic acid solutions at concentrations of 20, 40 and 60 mg L^-1 through foliar spraying, on the first and first trifoliate leaves. Every fifteen days enzyme activities were analyzed. Results showed a decrease of biochemical-physiological effects caused by Pb²⁺ in the enzymatic systems of plants treated with humic acids, stating categorically that they may mitigate the stress provoked by metals in the phenological stages evaluated in bean crop, being 40 mg L^-1 the most prominent dosage.

Keywords: humic substance, oxidative stress, defense mechanism

INTODUÇÃO

A contaminação dos solos por xenobióticos exige a aplicação de tecnologias muitas vezes inacessíveis para sua recuperação, e a utilização de plantas, especificamente aquelas com potencial para a fitoextração, podem em muitos casos atuar como agentes de fitorremediação. Uma das principais fontes ambientais de alguns metais como o Pb²⁺ tem sido a gasolina, e a exposição ao mesmo no meio profissional é produzida fundamentalmente em atividades de mineração e fabricação de tintas, louças e cerâmicas. No caso das plantas esse cátion pode provocar: (i) distúrbios na mitose; (ii) indução de micronúcleos; (iii) alteração da permeabilidade da membrana e; (iv) variação na atividade de enzimas, em resposta ao estresse oxidativo gerado no interior celular pelo metal (Corpas y Barroso, 2016). 

Várias pesquisas destacam o uso de plantas ou microrganismos na reabilitação de áreas degradadas, uma vez que poucas formas de vida sobrevivem nestas condições. Tem-se demostrado que algumas espécies de leguminosas possuem potencial para a fitoextração do metal atingindo até 400 mg kg^-1 de Pb²⁺ nas raízes (Almeida et al., 2008), o que indica que existem mecanismos ainda não estudados que permitem a tolerância destas plantas ao meio contaminado. Recentemente têm se mostrado os efeitos benéficos dos ácidos húmicos (AH) como constituintes da matéria orgânica do solo. Estes efeitos incluem à estimulação de diferentes processos bioquímico-fisiológicos como: (i) emergência e proliferação de raízes laterais a partir de sítios específicos de mitose; (ii) modificações nas atividades de diversas enzimas e conteúdo de metabolitos intracelulares; (iii) variação na síntese de pigmentos e; (iv) atividade tipo hormonal (García et al., 2016). Por esta razão objetivou-se com o presente trabalho avaliar as potencialidades dos AH na modificação dos mecanismos de defesa de plantas de feijão que estejam submetidas ao estresse por Pb²⁺, tentando também elucidar a interação intermolecular que liga os componentes húmicos ao metal para estabelecer uma relação mais precisa num sistema planta - ácido húmico - metal.

METODOLOGIA

O trabalho foi desenvolvido em casa de vegetação. O material vegetal foi obtido a partir da germinação de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L. var. CC-25-9-N) certificadas pelo Instituto Nacional de Ciências Agrícolas de Cuba. Os AH foram extraídos a partir de vermicomposto de esterco bovino com três meses de maturidade e deles foi feita a caracterização química, física e espectroscópica. Os valores obtidos das relações H/C, O/C, C/N e acidez total mostraram semelhança aos informados pela International Humic Substances Society (IHSS).

Tratamentos – As sementes foram semeadas em dois canteiros de 0,50 m × 2,30 m de longitude em um solo Ferralítico vermelho típico segundo a classificação cubana (Hernández et al., 1999), tipo Ferrasols segundo bases de dados de referência mundial (IUSS Working Group WRB, 2007), sendo um dos canteiros previamente contaminado com Pb²⁺ (100 mg kg^-1) e outro não contaminado. Cada canteiro foi dividido em quatro partes, três tratamentos e um controle (4 × 2), resultando em oito tratamentos, cada um com 30 plantas. Após a germinação, as plantas foram tratadas com aplicações foliares de AH nas concentrações de 20, 40 e 60 mg L^-1 e água como controle. As aplicações foram realizadas nas manhãs a partir da emissão da folha primária e da primeira folha trifoliolada (PFT). As atividades enzimáticas foram determinadas com a emissão da PFT e da terceira folha trifoliolada (TFT).

Análise enzimática – A quantificação da enzima Fenilalanina-amonio-liase (PAL) foi feita a partir de um extrato enzimático e posterior incubação a 40 ºC durante 30 minutos sendo lida à absorbância de 290 nm (Zhang et al., 2000). Para o caso da prolina o material vegetal foi homogeneizado com ácido sulfosalicílico 3 % sendo a absorbância lida a 520 nm utilizando tolueno como branco (Bates et al., 1973). A determinação da Nitrato reductase (NR) e do conteúdo de Nitratos totais foram feitos segundo Harper (1981), sendo lida à absorbância de 540 e 410 nm respectivamente num espectrofotómetro (RayLihght UV-2100). Todos os reagentes utilizados foram da mais alta pureza adquiridos da Merck e da Sigma-Aldrich.

Determinação de Pb²⁺ – As determinações analíticas do Pb²⁺ foram feitas num Fast Sequential Atomic Absorption Spectrometer VARIAN – AA240FS no Laboratório de Radioisótopos do IBCCF da UFRJ. As plantas foram submetidas a digestão com HNO₃ até dissolução total e para o Pb²⁺ pseudototal no solo foi utilizada a digestão com água-régia (HCl + HNO₃ - 3:1) através de sistema de digestão em forno de micro-ondas (CEM - modelo MDS-2000) sendo o extrato recuperado em 50 mL (Nieuwenhuize et al., 1991). Os resultados relativos à determinação do Pb²⁺ foram feitos tendo em consideração materiais certificados de referência (NIST SRM 2709 para solo e NIST SRM 1573ª para o caso das plantas).

Análise estatística - A informação obtida foi processada através de uma análise de variância (ANOVA) usando o pacote estatístico Statgraphic v. 5.1 plus e p<0,05 (Tukey) para a prova de comparação de médias.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Componentes do metabolismo antioxidante e do nitrogênio - Na fase vegetativa do feijão em condições de estresse, se encontrou que a biossíntese de compostos fenólicos é favorecida, dada pela elevada atividade da PAL nos diferentes tratamentos (Figura 1).

A atividade da enzima aumentou ao longo do tempo nas duas avaliações realizadas, provavelmente como um mecanismo de defesa de preparação da planta para a próxima fase fenológica, pois a síntese da PAL está interligada ao sistema de resistência do metabolismo dos fenilpropanoides (Zhang y Liu, 2015). O tratamento de AH-40 mg L^-1 foi aquele que mostrou a maior expressão, o que se corresponderia com a maior síntese de compostos fenólicos com capacidade de quebra de cadeias de formação de radicais, demostrando propriedades antioxidantes (Barros et al., 2016). Estas evidencias experimentais explicariam o fato de que as plantas com a adição dos AH não apresentaram nenhum sintoma de ataque de patógenos, ao contrário do tratamento controle.

As concentrações de prolina que apresentaram as folhas (Figura 2) são consideradas como uma resposta as Espécies Reativas do O₂ (EROs) formadas pela presença do metal. O principal rol da síntese deste aminoácido é a osmoregulação, estabilização de estruturas subcelulares e eliminação de radicais livres; processos que geralmente ocorrem como resposta às condições de sequia, salinidade ou infeções por patógenos (Wu et al., 2017). No tratamento com a presença somente do metal, a síntese de prolina alcançou valores nos dois momentos de avaliação, de até duas vezes o valor do tratamento controle, o que poderia indicar um possível transporte do metal até as folhas, induzindo este mecanismo de resposta. O fato de que os tratamentos com AH apresentassem valores de conteúdo de prolina menores ou semelhantes ao controle, indica que a concentração deste metabolito nas células das folhas foi devido à presença do metal e não pela adição de AH.

A diminuição do conteúdo de prolina nos tratamentos com Pb²⁺-AH comparado ao tratamento que somente continha o Pb²⁺, possivelmente se deve a um mecanismo de quelação dos AH com o metal, convertendo-o em uma espécie não reativa no interior celular. Pesquisas relacionadas com este aminoácido (Howladar, 2014) mostraram que o conteúdo de prolina aumentou significativamente em resposta à indução de estresse por NaCl e CdCl₂ em plantas de feijão. A maioria dos estudos referem-se à prolina como sintetizada fundamentalmente na raiz, mas no nosso trabalho foi encontrado que também pode ser sintetizada nas folhas, e que as concentrações podem variar dependendo da magnitude do estresse.

A atividade da NR (Figura 3) mostrou um aumento por cima dos níveis do tratamento controle em todos os tratamentos correspondentes a adição dos AH, incluindo aqueles que tinham o Pb²⁺, que foram superiores ao que somente tinha o metal. A adição foliar dos AH poderia estar relacionada com um aumento da síntese da enzima nas folhas e da produção de amônio nas raízes, o que se traduz em uma maior disponibilidade de equivalentes de redução e de glutamato respetivamente, compostos necessários para a síntese de fitoquelatinas, que são peptídeos que formam parte do mecanismo de defesa das plantas (Li et al., 2016).

O conteúdo total de nitratos (Tabela 1), foi mais elevado nas folhas que na raiz, aumentando no tempo nos dois órgãos avaliados. Estes valores nas folhas são de grande importância já que é bem conhecido que a absorção de NO₃^- requer energia, e o transporte deste ânion dentro da célula acontece via simporte de prótons 2 H⁺: NO₃^- (Taiz y  Zeiger, 2013) os quais podem ser gerados por enzimas tipo ATPasas. Neste sentido foi demostrado que AH isolados de vermicomposto de esterco bovino estimulam a absorção de nitratos, induzindo a atividade da H⁺-ATPasa de membrana plasmática, presumivelmente por um efeito tipo auxina (Martínez-Balmori et al., 2014).

Em cada fase fisiológica avaliada foi feita uma contagem dos nódulos formados nas raízes, o qual aumentou no tempo. O número de nódulos foi maior no tratamento correspondente a 40 mg L^-1 de AH, tanto na adição somente do AH quando na interação Pb²⁺-AH, o que se corresponde também com o conteúdo de nitratos totais e atividade da enzima NR na raiz (Figura 3). Estudos a partir de raízes de plantas cultivadas em solo com presença de Pb²⁺ mostraram formação de nódulos com redução da colonização micorrízica (Schneider et al., 2016). Os resultados demostram que o feijão é capaz de desenvolver a nodulação na presença de 100 mg kg^-1 de Pb²⁺, porém, estudos futuros de isolamento e identificação dos microrganismos das raízes nestas condições terão que ser feitos.

Conteúdo de Pb - O solo contaminado artificialmente com Pb²⁺ apresentou teor pseudototal do metal de aproximadamente 129,2 mg kg^-1 antes da plantação (Tabela 2) e de 12,023 mg kg^-1 depois de culminado o estudo. Isto significa que o cultivar de feijão foi capaz de extrair do solo aproximadamente 117 mg kg^-1 de Pb²⁺.

Em condições naturais valores do conteúdo de Pb²⁺ no solo acima de 100 mg kg^-1 têm sido reportado somente para alguns solos no Japão, Dinamarca e outros poucos países por impacto da contaminação (Nakata et al., 2017). O conteúdo de Pb²⁺ nas diferentes partes das plantas de feijão é demonstrado na Tabela 3. Os teores do metal detectados na raiz foram maiores que os da parte aérea sendo os tratamentos com a presença do AH-40 mg L^-1 aquele onde se mostrou a maior extração do metal. Estudos de Venkatachalam et al. (2017), afirmam que as espécies de plantas tolerantes ao Pb²⁺ acumulam maiores concentrações nas raízes. Em nossas condições as plantas de feijão não evitaram a absorção do metal, mas limitaram sua translocação para a parte aérea, o que poderia ser uma estratégia para conseguir a tolerância ao metal.

Na semente não foi detectado o metal, a exceção de uma mínima quantidade encontrada no tratamento que somente continha o Pb²⁺, resultados estes de grande importância tendo em conta que o feijão é consumido amplamente nos países de Latinoamérica, especialmente nas classes sociais de menor poder aquisitivo, constituindo a principal fonte de proteínas, minerais, vitaminas e fibras, devido a seu menor custo em relação à de origem animal.

CONCLUSÕES

-Todos os tratamentos correspondentes à interação Pb²⁺-AH mostraram uma variação na atividade enzimática dependendo da concentração em estudo e da fase fisiológica da cultura. Para o caso da PAL e o metabolismo do N, a tendência foi o aumento no tempo, como uma resposta positiva dos AH na formação de compostos fenólicos que possam dar uma resistência biológica e, a absorção de nitratos, componentes fundamentais de aminoácidos, proteínas e síntese das próprias enzimas de estresse oxidativo.

-A concentração de 40 mg L^-1 de AH foi a que mostrou a melhor resposta ao estresse, podendo-se utilizar como bioestimulante orgânico e possível ativador de mecanismos de adaptação, propiciando também a maior absorção do metal no solo.