The experiments were carried out in the vegetative phase of Phaseolus vulgaris L. plants, under laboratory conditions, in the Chemistry Department at the Agricultural University of Havana. The plants were obtained from seeds of the CC-25-9-N variety, certified by the National Institute of Agricultural Sciences (INCA), of which no report was found on their ability to accumulate metals.

Twenty seeds were germinated in plastic trays of 9 × 13 cm with the corresponding solutions of Pb(NO₃)₂, NiSO₄.6H₂O and CuSO₄.5H₂O (high quality, Sigma-Aldrich) at six different concentrations shown in Table 1 and taking into account permissible values previously reported (Kabata, 2001). A control treatment (water) was also used for 19 treatments, with five replicas each.

Fifteen days after seed germination (DAG), the mean lethal dose (MLD) and phytotoxicity index (PI) evaluations were performed. The MLD was considered as the one that destroyed 50 % of the individuals in the population and the PI as that corresponding to the number of affected plants (Rivera et al., 2005).

It was performed through measurements of pH and electrical conductivity. Ten discs of 0.5 cm in diameter were taken in triplicate from the true leaves of five plants of each treatment, which were introduced into containers with 30 mL of deionized water. The system was kept under constant stirring (magnetic stirrer) for 30 min, after this time reading of both variables were made every 5 min at a constant temperature of 25 °C (Schulze et al., 2005). The pH of the solution was measured in a pH meter (Model PHSJ-3F, 0.01pH ± 1bit) and the electrical conductivity in a conductometer (Model DDSJ-308, ± 0.5% (FS) ± 1digit).

Bean seeds to germinate were placed in plastic trays as it was described above, with two concentrations of the metal cations (corresponding to the MLD and the Limit of Tolerance) and a control treatment (water), for seven treatments with five replicas each. The activity of peroxidases enzymes (POX) (EC: 1.11.1.7) was evaluated, which was determined at 15 DAG from a mass of 0.5 g of leaves. A reaction mixture consisting of Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ 0.05 mol L^-1 pH 5.5, guaiacol 0.05 mol L^-1, H₂O₂ (2 % v: v) and 1 mL of an enzyme extract prepared from the addition of the same buffer at pH 5.8, 5 % PVP, filtered and centrifuged at 10,000 rpm. The absorbance reading was performed at 470 nm for 4 min at 20 sec intervals on a UV-visible spectrophotometer (Rayleigh-1601). The results were expressed in Δ₄₇₀ min^-1 g^-1 protein (Bronikowski et al., 2018).For guaiacol peroxidase (GPX) (EC: 1.11.1.7) the same mass of plant material was used and the same reaction mixture was prepared with the difference that the buffer used was at a value of pH 6.1 and pH 7.0 for the enzymatic extract. The absorbance reading was performed at 420 nm and the results were expressed in ∆₄₂₀ min^-1 g^-1 protein (Wilkesman et al., 2014).

Data were processed using a simple classification ANOVA with the Statgraphic statistical package v. 5.1 plus, and the means comparison test was performed by Tukey p<0.05.

The mean lethal dose (MLD) values for the Pb²⁺, Ni²⁺ and Cu²⁺ cations, where germination of 50 % of the seeds was not reached, were 125, 10 and 30 ppm, respectively. Another indicator to consider is the phytotoxicity index (PI), which represents the plant's response to exposure to metals. The higher PI value represents a greater phytotoxic or stress effect of the metal, while the smaller means the opposite. PI values in bean seedlings exposed to cations of Pb²⁺, Ni²⁺ and Cu²⁺ are shown in Figure 1.

For the treatment with Pb²⁺, the PI responds with higher values to the highest concentration of 125 ppm. However, in the case of Ni²⁺ and Cu²⁺ at concentrations below the maximum, a notable PI is already observed. This new and useful result indicates that bean plants, in their early stages of the vegetative phase, tolerate higher concentrations of Pb²⁺ than other metals such as Ni²⁺ and Cu²⁺. This is probably because Pb²⁺ does not present any recognized biological function in plants, so that when introduced into the cell, detoxification mechanisms are activated and rapid accumulation in vacuoles occurs (Shah et al., 2018).

In the cases of Ni²⁺ and Cu²⁺, they are among the microelements that in small concentrations are used to perform vital functions in plants, such as electron transfer reactions, specific enzyme cofactors and constituents of the structure of several molecules (Pokorska et al., 2018). An increase in the concentration of these metals would not only affect these processes, but, in addition, those associated with oxidative stress at the cellular level, caused by their high concentration. These results allow us to know what are the concentrations from which studies can be carried out on tolerance mechanisms in bean cultivation, since they would be those in which the crop survives without showing apparent damage. These are for the case of Pb²⁺ 100 ppm, for Ni²⁺ 5 ppm and for Cu²⁺ 20 ppm, assuming these are limits of phytotoxicity or crop tolerance.

Those findings are of great importance for current agriculture, mainly because in Cuba the planting of large-scale crops in soils that were unused was accelerated. This implies that, if the objective was to sow beans, a crop of national preference, without carrying out a study of the chemical-physical characteristics of the soil and it had high levels of bioavailable Pb²⁺, the risk of direct contamination to the man through the food chain would occur. In the case of Ni²⁺, the practical application would be different. Due to its low phytotoxicity limit in this crop, it could give rise to relatively simple bioassays that allow detecting areas at risk of being contaminated with this cation.

The pH and electrical conductivity values of seedlings from germinated seeds in the presence of Pb²⁺ are presented in Figure 2, with variations observed in both indicators in most treatments with respect to control. Regarding the pH, the 25 ppm treatment started with a value greater than 7.4 and after 10 min it went down to find a relatively stable behavior around pH ꞊ 7 until 30 min. At concentrations of 10 ppm, it started with a pH value lower than 7. However, after 5 min, it rose to 7.6 and after 15 min, it reached stability at values close to pH ꞊ 7.4.

For the concentrations of 50, 75, 100 and 125 ppm, pH values were started around neutrality, although the concentration of 50 ppm after 25 min rose until it reached its peak next to the 10 ppm treatment. The rest of the concentrations were maintained with constant pH values up to 30 min following a similar behavior to the control, although with values ​​slightly higher than the latter.

Although the cytoplasmic pH must be maintained above neutrality, there are changes that can affect this value. Plants when subjected to stress can cause extrusion or entry of H⁺ into the cellular interior. Small variations in pH are generally controlled by the buffer capacity of the cytoplasm, but this is a short-lived mechanism that is only maintained for 6-8 min (Budar and Roux, 2011). Therefore, the plants of the present study would have to look for alternative routes of maintenance of membrane integrity, such as synthesizing or destroying organic acids for the control of pH variations, carrying out a physical-chemical mechanism of extrusion of H⁺ through the cytoplasm or a pumping of H⁺ to the vacuole through the tonoplast (Armbruster et al., 2017).

In the case of electrical conductivity, the more specific behavior was produced by the concentration of 125 ppm that remained similar to that of the control treatment, although with lower values until 10 min, at which point it dropped sharply until a balance or stability was found at 20 min. The highest concentration of 125 ppm of Pb²⁺ was the one that produced the greatest modification in the cell membrane, since it induced a sharp change in the measurement of electrical conductivity until trying to find a homeostasis of the system.

This balance could be achieved from the exit or entry of H⁺, as well as the entrance of the metal into the cellular interior by means of pumps in the membranes. It has been proven that there are various specific pumps for toxic metal cations in the plants. Specific ATP-dependent enzymes act on these and have a structure similar to Na⁺/K⁺ pumps of plasma membranes (Li et al., 2016). It is possible that, with the entrance of the metal into the cellular interior, structural changes or rearrangements in the composition of the membrane lipids were being carried out, which caused changes in the conductivity, behavior that is also revealed in the cation Ni²⁺ shown in Figure 3.

In the case of Ni²⁺, measurements could only be made in those treatments with sufficient plant material (concentrations of 1, 5 and 10 ppm). The concentration of 5 ppm began with a pH value near to 7, from this moment it began to decrease until 15 min, where it returned to take higher values around 6.8 trying to find a stabilization. The concentration of 10 ppm began with a pH value close to 7 and dropped sharply to 10 min, at which point a gradual rise was verified. Finally, the 1 ppm treatment, although it started with values higher than those of the control treatment, over time, it maintained a similar behavior to that. In the case of conductivity, all treatments were maintained with a behavior similar to that of the control treatment, although with lower conductivity values. This trend was also maintained for the case of Cu²⁺ shown in Figure 4.

In the seedlings that germinated with the Cu²⁺ solutions, the greatest differences between the treatments were caused in the pH measurement. For all concentrations of the metal under study, similarity was expressed regarding the general trend of variation as a function of time. Except for the concentration of 5 ppm that started with pH values higher than those of the control treatment and had a rapid decrease until 15 min, at which point an increase in its value began approaching that of the other concentrations used.

It is known that Cu²⁺ affects among other factors the transport of transmembrane ions, the concentration of intracellular Ca²⁺ and cell turgidity, as well as interfering with the transduction of cellular signals such as those of Ca²⁺ as a second messenger (Sun et al., 2010). This metal could cause changes in transport in the cell by displacing Ca²⁺ from the membranes, and that leads to changes in intracellular pH. Another possible mechanism is the incorporation of Cu²⁺, once it is in the cytosol, to enzymes, amino acids or polypeptides such as phytokelatins, for a transport to the vacuolar interior, which would also cause a change in pH. It has been proven that Cu²⁺ induces changes in membrane permeability attributed to an increase in non-selective conductivity and to the inhibition or low activity of plasma membrane H⁺-ATPase pumps (Li et al., 2016).

All those changes that affect the permeability of the membrane depend largely on its composition. The opening of the channels from transmembrane proteins and transduction signals, the transporters and the pumps, can be affected depending on the stress that is caused. By penetrating these systems, metal cations can cause the production of reactive oxygen species that are detected by receptors that activate protein kinases or signals in kinase cascades, changes in Ca²⁺ and calmodulin levels, regulation of gene expression and different transcription factors that would trigger, depending on the metal and its concentration, a specific response in the crop.

It could be considered that the bean variety CC-25-9-N shows a behavior of metal accumulator plant, which leads to establishing its potential in the possible negative effect for the trophic chain, not only because of the possibility of reaching the edible fruit, but because of the danger of using crop residues as a source of organic fertilizer. The results found present a great practical value for the precepts of agroecology and sustainable agriculture, which in turn, technically justify the systematic control of the content of metals in normative documents of agricultural pollution and Codex standards, based on the evaluation of risks organized by FAO and WHO.

The POX and GPX enzyme activity values for the Pb²⁺, Ni²⁺ and Cu²⁺ cations at concentrations corresponding to the MLD and phytotoxicity limit or tolerance, are shown in Table 2.

Enzyme activity values indicate the removal of reactive oxygen species due to oxidative stress. The treatment corresponding to the concentration of 100 ppm of the Pb²⁺ cation showed higher values than the control, however, at a harmful concentration such as 125 ppm, values that do not differ from the control treatment were obtained, probably due to the activation of other antioxidant systems. The treatments corresponding to the microelements, in each of the concentrations studied, did not exceed the control values, presumably because they were incorporated into the plant's own metabolites or enzymes. The induction of “not so intense” stress could be used in signaling pathways to promote acceleration effects in the growth and development of seedlings, such as the synthesis of intermediary compounds and metabolites. It should be considered that germination was carried out under controlled conditions, not in a natural system where the own soil organic matter or the interaction with the microorganisms facilitated the absorption of the cations under study to the roots.

It is known that POX enzymes catalyze one of the final steps of lignin biosynthesis in roots (Kumar and Prasad, 2018). In addition, GPX participates in metabolic reactions of lignin biosynthesis and AIA decomposition (Falade et al., 2018). It is possible that these seedlings, and mainly those exposed to Pb²⁺, could activate as a defensive response the lignification of the root endodermis to prevent transport of the metal to the stem by keeping it out of the central cylinder, behavior demonstrated for metals such as Zn²⁺, Cu²⁺ and Cd²⁺ (Ledesma, 2014).

GPX also catalyzes the oxidation of H⁺ donor chemical species due to the absence of a specific substrate, sometimes using guaiacol and sometimes ascorbate as a substrate for their reactions (Smirnoff, 2018). Ascorbate is one of the precursors for the synthesis of phytokelatins, so if there is not enough of this peptide in the leaves to transport Pb²⁺ to the vacuoles, it is still potentially toxic and GPX would continue to eliminate the reactive species that generate inside the cell. It justifies the high values of this enzyme activity for that metal.

Changes in pH values and electrical conductivity, variables associated with membrane permeability, as well as POX and GPX activities depended on both, the metal and its concentration, so it is possible to infer some specificity in the plant - metal interaction, suggesting the predominance of different response mechanisms.

Los experimentos se desarrollaron en la fase vegetativa bajo condiciones de laboratorio, en el Departamento de Química de la Universidad Agraria de La Habana. Se trabajó con plantas de Phaseolus vulgaris L. obtenidas a partir de semillas de la variedad CC-25-9-N, certificadas por el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), de la cual no se encontró reporte sobre su capacidad para acumular metales.

Se colocaron 20 semillas para germinar en bandejas plásticas de 9 × 13 cm con las correspondientes disoluciones de Pb(NO₃)₂, NiSO₄.6H₂O y CuSO₄.5H₂O (de calidad QP, Sigma-Aldrich) a seis concentraciones diferentes mostradas en la Tabla 1 y teniendo en cuenta valores permisibles previamente informados (Kabata, 2001). Fue empleado además un tratamiento control (agua) para un total de 19 tratamientos, con cinco réplicas cada uno.

A los 15 días después de la germinación (DDG) de las semillas, se realizaron las evaluaciones de dosis letal media (DLM) e índice de fitotoxicidad (IF). Se consideró como DLM aquella que destruyó al 50 % de los individuos de la población y al IF como aquel correspondiente al número de plantas afectadas (Rivera et al., 2005).

Fue realizado a través de mediciones del pH y la conductividad eléctrica. Se tomaron por triplicado 10 discos de 0,5 cm de diámetro de las hojas verdaderas de cinco plantas de cada tratamiento, que fueron introducidos en recipientes que contenían 30 mL de agua desionizada. El sistema se mantuvo en constante agitación (agitador magnético) durante 30 min, pasado este tiempo lecturas de ambas variables se realizaron cada 5 min a una temperatura constante de 25 ºC (Schulze et al., 2005). El pH de la disolución fue medido en un pHmetro (Modelo PHSJ-3F, 0.01pH ± 1bit) y la conductividad eléctrica en un conductímetro (Modelo DDSJ-308, ± 0.5 % (FS) ± 1digit).

Se colocaron semillas de frijol a germinar en bandejas plásticas como fue descrito anteriormente, con dos concentraciones de los cationes de metales (correspondientes a la DLM y Límite de Tolerancia) y un tratamiento control (agua), para un total de 7 tratamientos con cinco réplicas cada uno. Se evaluó la actividad de enzimas peroxidasas (POX) (EC:1.11.1.7), la cual fue determinada a los 15 DDG a partir de una masa de 0,5 g de hojas. Se preparó una mezcla de reacción consistente en Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ 0,05 mol L^-1 de pH 5.5, guaiacol 0,05 mol L^-1, H₂O₂ (2 % v: v) y 1 mL de un extracto enzimático preparado a partir de la adición del mismo buffer a pH 5.8, PVP 5 %, filtrado y centrifugado a 10 000 rpm. La lectura de absorbancia se realizó a 470 nm durante 4 min a intervalos de 20 seg en un espectrofotómetro UV-visible (Rayleigh-1601) y los resultados fueron expresados en ∆₄₇₀ min^-1 g^-1 proteína (Bronikowski et al., 2018). Para la guaiacol peroxidasa (GPX) (EC:1.11.1.7) se utilizó la misma masa de material vegetal y se preparó la misma mezcla de reacción con la diferencia de que el buffer utilizado fue a un valor de pH 6.1 y pH 7.0 para el extracto enzimático. La lectura de absorbancia se realizó a 420 nm y los resultados fueron expresados en ∆₄₂₀ min^-1 g^-1 proteína (Wilkesman et al., 2014).

Los datos fueron procesados mediante un ANOVA de clasificación simple con el paquete estadístico Statgraphic v. 5.1 plus, y la prueba de comparación de medias se realizó por Tukey p<0,05.

Los valores de dosis letal media (DLM) para los cationes Pb²⁺, Ni²⁺ y Cu²⁺, donde no se alcanza la germinación del 50 % de las semillas, fueron de 125, 10 y 30 ppm respectivamente. Otro indicador a tener en cuenta es el índice de fitotoxicidad (IF), el cual representa la respuesta de la planta a la exposición a los metales. El valor de IF más elevado representa mayor efecto fitotóxico o de estrés del metal, mientras que el más pequeño significa lo contrario. Los valores de IF en las plántulas de frijol expuestas a los cationes de Pb²⁺, Ni²⁺ y Cu²⁺ se muestran en la Figura 1.

Para el tratamiento con Pb²⁺ el IF responde con mayores valores a la concentración más elevada de 125 ppm. Sin embargo, en el caso del Ni²⁺ y el Cu²⁺ a concentraciones inferiores a las máximas, ya se observa un notable IF. Este nuevo y útil resultado indica que las plantas de frijol en sus primeras fases de la etapa vegetativa toleran mayores concentraciones de Pb²⁺ que de otros metales como el Ni²⁺ y el Cu²⁺. Esto es posiblemente debido a que el Pb²⁺ no presenta ninguna función biológica reconocida en las plantas, por lo que al introducirse en la célula se activan mecanismos de desintoxicación y ocurre una rápida acumulación en vacuolas (Shah et al., 2018).

En los casos del Ni²⁺ y el Cu²⁺, ellos se encuentran entre los microelementos que en pequeñas concentraciones son utilizados para llevar a cabo funciones vitales en las plantas, tales como reacciones de transferencia de electrones, cofactores de enzimas específicas y constituyentes de la estructura de varias moléculas (Pokorska et al., 2018). Un incremento en la concentración de estos metales no solo afectaría estos procesos, sino que, además, se suman los propios del estrés oxidativo a nivel celular, originados por su elevada concentración.

Estos resultados permiten conocer cuáles son las concentraciones a partir de las cuales se pueden realizar estudios acerca de mecanismos de tolerancia en el cultivo del frijol, ya que serían aquellas en las cuales sobrevive el cultivo sin mostrar daños aparentes, que serían para el caso del Pb²⁺ 100 ppm, para el Ni²⁺ 5 ppm y para el Cu²⁺ 20 ppm, asumiéndose éstas como límites de fitotoxicidad o tolerancia del cultivo.

Lo encontrado es de gran importancia para la agricultura actual, debido fundamentalmente a que en Cuba se aceleró la siembra de cultivos a gran escala en suelos que se encontraban ociosos. Lo anterior implica que, si el objetivo es sembrar frijol, cultivo de preferencia nacional, sin realizar un estudio de las características químico-físicas del suelo y éste se encontrara con elevados niveles de Pb²⁺ biodisponible, se podría correr el riesgo de una contaminación directa al ser humano a través de la cadena trófica. Para el caso del Ni²⁺ la aplicación práctica sería diferente, pues dado su bajo límite de fitotoxicidad, pudiera dar origen a bioensayos relativamente simples que permitan detectar áreas con riesgo de estar contaminadas con este catión.

En la Figura 2 se presentan los valores de pH y conductividad eléctrica de plántulas procedentes de semillas germinadas en presencia de Pb²⁺, observándose variaciones en ambos indicadores en la mayoría de los tratamientos con respecto al control. En cuanto al pH el tratamiento de 25 ppm comenzó con un valor superior a 7,4 y a los 10 min descendió para encontrar un comportamiento relativamente estable alrededor de un pH ꞊ 7 hasta los 30 min. A concentraciones de 10 ppm comenzó con un valor de pH inferior a 7. Sin embargo, a partir de los 5 min ascendió a 7,6 y luego de 15 min alcanzó una estabilidad a valores cercanos de pH ꞊ 7,4.

Para las concentraciones de 50, 75, 100 y 125 ppm se comenzó con valores de pH alrededor de la neutralidad, aunque la concentración de 50 ppm a partir de los 25 min ascendió hasta encontrar su punto máximo junto al tratamiento de 10 ppm. El resto de las concentraciones se mantuvieron con valores de pH constantes hasta los 30 min siguiendo un comportamiento similar al control, aunque con valores ligeramente superiores al de éste.

Aunque el pH citoplasmático debe ser mantenido sobre la neutralidad, existen cambios que pueden afectar este valor. Las plantas cuando son sometidas a un estrés pueden provocar la extrusión o entrada de H⁺ hacia el interior celular. Las pequeñas variaciones del pH generalmente son controladas por la capacidad tampón del citoplasma, pero este es un mecanismo de corta duración que sólo es mantenido de 6-8 min (Budar y Roux, 2011). Por tanto, las plantas del presente estudio tendrían que buscar rutas alternativas de manutención de la integridad de la membrana, como sintetizar o destruir ácidos orgánicos para el control de las variaciones del pH, llevar a cabo un mecanismo físico-químico de extrusión de H⁺ a través del citoplasma o un bombeo de H⁺ a la vacuola a través del tonoplasto (Armbruster et al., 2017).

Para el caso de la conductividad eléctrica el comportamiento más específico lo produjo la concentración de 125 ppm que se mantuvo similar al del tratamiento control, aunque con valores mucho más bajos hasta los 10 min, momento a partir del cual descendió bruscamente hasta encontrar un equilibrio o estabilidad a los 20 min. La concentración más elevada de 125 ppm de Pb²⁺ fue la que produjo la mayor modificación en la membrana celular, ya que indujo un brusco cambio de la medida de la conductividad eléctrica hasta intentar encontrar una homeostasis del sistema.

Este equilibrio pudiera alcanzarse a partir de la salida o entrada de H⁺, así como la entrada del metal al interior celular mediante bombas en las membranas. Se ha comprobado que en las plantas existen diversas bombas específicas para los cationes de metales tóxicos. Sobre éstas actúan enzimas específicas dependientes de ATP y poseen una estructura similar a las de Na⁺/K⁺ de las membranas plasmáticas (Li et al., 2016). Es posible que, con la entrada del metal al interior celular, se estuviesen llevando a cabo cambios estructurales o reordenamientos en la composición de los lípidos de la membrana, lo cual provocó cambios en la conductividad, comportamiento que también se pone de manifiesto en el catión Ni²⁺ mostrado en la Figura 3.

Para el caso de este metal sólo se pudieron realizar mediciones en aquellos tratamientos con material vegetal suficiente (concentraciones de 1, 5 y 10 ppm). La concentración de 5 ppm comenzó con un valor de pH próximo de 7, a partir de este momento mostró una reducción hasta los 15 min, donde regresó a valores alrededor de 6.8 tratando de encontrar una estabilización. La concentración de 10 ppm comenzó con un valor de pH cercano a 7 y descendió bruscamente hasta los 10 min, momento a partir del cual se verificó un paulatino ascenso. Por último, el tratamiento de 1 ppm, aunque comenzó con valores superiores a los del tratamiento control, con el paso del tiempo mantuvo un comportamiento similar al de éste. Para el caso de la conductividad, todos los tratamientos se mantuvieron con un comportamiento similar al del tratamiento control, aunque con valores de conductividad inferiores, tendencia esta que se mantuvo también para el caso del Cu²⁺ mostrado en la Figura 4.

En las plántulas que germinaron con las disoluciones de Cu²⁺, donde se provocaron las mayores diferencias entre los tratamientos fue en la medida del pH. Para todas las concentraciones del metal en estudio se manifestó similitud en cuanto a la tendencia general de variación en función del tiempo, excepto la concentración de 5 ppm que comenzó con valores de pH superiores a los del tratamiento control y tuvo un rápido descenso hasta los 15 min, momento a partir del cual comenzó un ascenso de su valor aproximándose al de las otras concentraciones empleadas.

Es conocido que el Cu²⁺ afecta entre otros factores el transporte de iones transmembrana, la concentración de Ca²⁺ intracelular y turgencia de la célula, además de interferir en la transducción de señales celulares como las del Ca²⁺ como segundo mensajero (Sun et al., 2010). Este metal, al desplazar al Ca²⁺ de las membranas, pudiera provocar en la célula modificaciones en el transporte, lo que conlleva a cambios en el pH intracelular. Otro posible mecanismo es la incorporación del Cu²⁺ una vez en el citosol a enzimas, aminoácidos o polipéptidos como las fitoquelatinas, para un transporte al interior vacuolar, lo que provocaría también un cambio en el pH. Se ha comprobado que el Cu²⁺ induce cambios en la permeabilidad de la membrana atribuidos a un incremento en la conductividad no selectiva y a la inhibición o baja actividad de las bombas H⁺-ATPasa de membrana plasmática (Liu et al., 2018).

Todos aquellos cambios que afecten la permeabilidad en la célula, dependen en gran medida de la composición de la membrana plasmática. La apertura de los canales a partir de proteínas transmembrana y señales de transducción, los transportadores y las bombas, se pueden ver afectados en dependencia del estrés que se ocasione. Al penetrar por estos sistemas los cationes de metales, pueden provocar la producción de especies reactivas que son detectadas por receptores que activan proteínas quinasas o señales en cascadas de quinasas, cambios en los niveles de Ca²⁺ y calmodulina, regulación en la expresión de genes y diferentes factores de transcripción que desencadenarían, en dependencia del metal y su concentración, una respuesta específica en el cultivo.

Pudiera considerarse que la variedad de frijol CC-25-9-N muestra un comportamiento de planta acumuladora de metales, lo cual conlleva a establecer su potencialidad en el posible efecto negativo para la cadena trófica, no solamente por la posibilidad de llegar al fruto comestible, sino por el peligro de utilizar los restos de cosecha como fuente de abono orgánico. Los resultados encontrados presentan un gran valor práctico para los preceptos de la agroecología y la agricultura sostenible, que a su vez justifican técnicamente el control sistemático del contenido de metales en documentos normativos de agrocontaminación y en las normas del Codex, a partir de la evaluación de riesgos organizadas por la FAO y la OMS.

Los valores de actividad enzimática POX y GPX para los cationes Pb²⁺, Ni²⁺ y Cu²⁺ a concentraciones que se corresponden a la DLM y límite de fitotoxicidad o tolerancia, se muestran en la Tabla 2.

Los valores de actividad enzimática indican la remoción de especies reactivas de oxígeno producto de un estrés oxidativo. El tratamiento correspondiente a la concentración de 100 ppm del catión Pb²⁺ mostró valores superiores al control, en cambio a una concentración dañina como la de 125 ppm se obtuvo valores que no se diferencian del tratamiento control, probablemente producto a la activación de otros sistemas antioxidantes. Los tratamientos correspondientes a los microelementos, en cada una de las concentraciones estudiadas, no superaron los valores del control, debido presumiblemente a que fueron incorporados a metabolitos o enzimas propios de la planta. La inducción de un estrés “no tan intenso” pudo ser utilizado en vías de señalización para propiciar efectos de aceleración en el crecimiento y desarrollo de las plántulas, como la síntesis de compuestos y metabolitos intermediarios. Se debe considerar que la germinación se llevó a cabo en condiciones controladas, no en un sistema natural donde la propia materia orgánica del suelo o la interacción con los microorganismos les facilitasen a las raíces la absorción de los cationes en estudio.

Se conoce que las enzimas POX catalizan uno de los pasos finales de la biosíntesis de lignina en las raíces (Kumar y Prasad, 2018). Además, la GPX participa en reacciones metabólicas de biosíntesis de lignina y descomposición del AIA (Falade et al., 2018). Es posible que estas plántulas, y principalmente aquellas expuestas al Pb²⁺, pudieron activar como una respuesta defensiva la lignificación de la endodermis de la raíz para prevenir el transporte del metal al tallo manteniéndolo fuera del cilindro central, comportamiento demostrado para metales como Zn²⁺, Cu²⁺ y Cd²⁺ (Ledesma, 2014).

La GPX cataliza también la oxidación de especies químicas donadoras de H⁺ debido a la ausencia de un sustrato específico, utilizando en ocasiones al guaiacol y en otras al ascorbato como sustrato para sus reacciones (Smirnoff, 2018). El ascorbato es uno de los precursores para la síntesis de fitoquelatinas, por lo que si no hay suficiente cantidad de este péptido en las hojas para transportar al Pb²⁺ hacia las vacuolas, éste sigue siendo potencialmente tóxico y la GPX continuaría eliminado las especies reactivas que se generen en el interior de la célula, justificándose los elevados valores de la actividad de esta enzima para este metal.

Los cambios en los valores de pH y de la conductividad eléctrica, variables asociadas a la permeabilidad de la membrana, así como de las actividades POX y GPX dependieron tanto del metal, como de su concentración, por lo que es posible inferir cierta especificidad en la interacción planta - metal, lo que sugiere el predominio de mecanismos de respuesta diferentes.