The composition of the substrates is the main factor to determine the yield and methane potential. Most of the bibliographical sources report that the differences in the kinetics, potential and methane yield depend on the type of substrates utilized (Forster et al., 2012). The methods of substrates pretreatment have as object, to improve their anaerobic digestion qualities by altering their physical, chemical and biological properties. In spite of that, they show certain particularities such as increasing of the manipulation costs, increment of legislative requirements for stabilization and removal of possible pathogens, tendency to handle smaller nitrogen limits, which allows handling the age of these substrates and increasing the biodegradability of activated substrates (Zhong et al., 2011). Consequently, it is necessary to analyze the pre - treatments to use depending on the type, performance and costs.

Pre-biological treatments: the objective of the pre-biological treatments are to prepare the substrates for the enzymatic degradation and the best method and pre-treatment condition depends significantly on the substrates type. Among the utilized microorganisms to degrade organic substrates there are several types of mushrooms, such as: Carmelite, white and soft rotten, besides some types of bacteria’s (Kurakake et al., 2007). Taherzadeh and Karimi (2008) studied biological treatments in office paper with two chains of bacteria (Sphingomonas paucimobiles and Bacillus circulans), obtaining improvements in the enzymatic hydrolysis, as well as 94% of recovery of sugar. Depending on the substrate type (residuals of houses, waters of industries, residuals of still etc), the enzymatic attack can be carried out by different types of mushrooms or combinations of these (Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, etc).

Taniguchi et al. (2005), evaluated pre-biological treatments in rice straw using 4 white-rotten mushrooms (Phanerochaete chrysospurium, Tramete versicolor, Ceriporiopsis subvermispora and Pleurutus ostreatus) and the pre-treatment with Pleurutus ostreatus generated a selective degradation of lignin and an increment of the susceptibility of rice straw to the enzymatic hydrolysis. In addition, in the phase of solid fermentation of orange shell with chains of mushrooms, type Sporotrichum, Aspergillus, Fusarium and Penicillum, the constituent feeding capacity was improved and the level of antimicrobial substances was reduced. In a similar work Taherzadeh and Karimi (2008), used white-soft mushroom cultivations to decontaminate waste waters of olives milling, improving their digestion. Vintiloiu et al. (2009), investigated the influence of temperature and pH of several commercial enzymes on the degradation of corn ears and straw. According to these authors, the best effects were obtained at 50 ⁰C and the enzymes originated by mushrooms present their best potentialities to pH values between 4 and 6. However, the methane genesis takes place to values between 6 and 8, therefore, it would be necessary to look for an enzyme that maintains a good activity in these pH ranges.

Low energy requirement, no use of chemical and gentle environmental condition are the main advantages of the biological pre-treatments. However, the efficiency of these pre-treatments is sometimes low. For such a reason, the pre-biological treatments need of an extra state that assures the later enzymatic attack to these; this alternative can be carried out through previous pre-treatments such as physical or chemical.

Martínez et al. (2015) used a chemical-thermal pre treatment in some of the biomass that are valued in this investigation. Due to that, the present work constitutes a continuation of the use of special pre-treatments to use in the biodigestion of agricultural and of tavern residuals, which have been supported in investigations by Martinez et al. (2014), Martinez et al. (2015) and Martínez and García (2016).

The analysis of these bibliographical sources allows appreciating that the application of a pre-treatment with enzymes to organic residuals of type lignin-celluloses is very appropriate to favor the biodegradability and the methane production. This investigation is intended to apply a pre-treatment with enzymes to different types of biomass, studying their effect on biogas production.

This work was carried out in the Central University "Marta Abreu" of Las Villas, but the Company BIOPRACT GmbH, through investigators of the University of Hohenheim, Germany, donated the investigation material (Liquid cellulase enzymatic preparation, ZY maXX XL 200). The experimental results, fruit of combined investigation projects, were obtained from September 2017 until November 2018. Different effective norms for this investigation type were consulted as it is indicated next.

The substrates were characterized according to the norm VDI (2006)and following the characterization and general classification of substrates, the possibilities of ferment ability of the organic materials were determined. The agricultural residuals studied in the Cuban investigation project were sorghum (Sorghum R-132), sorghum (Sorghum halepense), sunflower (Helianthus annuus L JE-94), corn (Zea mays L), malanga (Colocasia esculenta L Schott), sweet potato (Ipomoea sweet potato) and potato (Solanum tuberosum Sw) (Martinez et al., 2014). In addition, a tavern residual was studied (white bread) (Martinez et al., 2016).

Later on, other agricultural residuals were study object such as natural pasture, mulatto pasture and CT-115. In the case of these agricultural residuals, samples were collected taking roots, shafts, leaves and fruits. These residuals were dried off and fractioned in particles of 1 mm of size, taking samples to carry out the investigations on laboratory scale in Germany and on field scale in Cuba. The investigations in Germany were executed in investigation stay developed in the University of Hohenheim between the months of September and November 2017.

In the Germany case, treatment was applied with enzymes and it was investigated with bovine inoculum. In Cuba, these investigations were replied on field scale. A pre-treatment was used with enzymes, the enzyme ZY ma XX XL 200 was added in dose of 100 µl/syringe for 350 mg substrate to value. The substrates inoculated with the enzyme were allowed resting during 4 hours, later on the inoculum was added (30 mL of porcine effluent of an anaerobium biodigester). Next, the substrates pre-treated and the inoculum were introduced in experimental syringes of 100 mL of capacity.

In Germany, bovine inoculum was used (cow manure), in Cuba pig inoculum was used (pig manure) coming from biodigesters in production. In both cases, the experimental syringes, were placed in a denominated addition Hohenheim Bench Test (HBT), to reason of three samples per substrate valued; as well as a sample in plastic container (plastic bottle), in order to investigating the evolution of the pH in the process of anaerobic digestion under field conditions. The object of valuation were the following parameters:

Starting from the input data, the following parameters were calculated by means of softwares elaborated for these ends (Gärtest nach VDI 4630) and following the norm VDI-4630 (2006):

Table 1 shows the test conditions in each biomass under research.

In Figure 1, the evolution of all substrates valued with the addition of enzymes and without them are observed. The best behavior took place with the grass mulatto substrate (0.268 m³ CH₄/kg oDM), followed by the CT-115 (0.258 m³ CH₄/kg oDM) and culminating with the natural grass (0.254 m³ CH₄/kg oDM). Superior increments were observed in all substrates that received the pre-treatment with enzymes with respect to those without the application of the referred pre-treatment. On the other hand, the obtained values are below the ones gotten by Martinez et al. (2014). It could be due to the potential of methane of these biomass and to the use of mixtures of roots, leaves, shafts and fruits of these agricultural biomass, which possess bigger quantity of fiber (cellulose and hemi cellulose),compared to the previous studies with these biomass in solitary.

Table 2 shows the results obtained with the substrates evaluated with and without the enzyme treatment.

In Table 2, it is observed that, in CT-115 pasture (the whole plant), mulatto pasture (only leaves) and natural pasture (the whole plant), the action of the enzyme complex enhances methane production. However, when replicating these experiments at the field level in Cuba, the results were not satisfactory. In the case of the experiments carried out in Cuba, a swine inoculum was used, but perhaps the limiting factor of the low yields obtained by the biomass investigated was the size of the particles. They were not sufficiently crushed due to the damage in the mill used and that could affect the interaction enzyme biomass. According to Brulé (2014), experiments in the enzymatic hydrolysis stage show low efficiency when enzymes are added to agricultural substrates. The author concluded that the efficiency of enzymes could be favored by the low content of recalcitrant fibers and lignin, low pH and temperature. In addition, he refers that, to achieve a positive effect of the addition of enzymes in productive practice, anaerobic bioreactors must have high organic load (OLR), low hydraulic residence time (HRT) and the substrates must have a mixture of energy crops. Therefore, these results are in contradiction with what was reported by Brulé et al. (2011). The results of this investigation indicate a positive effect with the addition of the enzyme ZY maXX XL 200 to the substrates evaluated, and when an appropriate inoculum density is used. The potential of the ZY maXX XL 200 enzyme, to favor the hydrolysis process, which is the limiting stage in anaerobic digestion of these types of waste, should be highlighted. When the hydrolysis is improved, the anaerobic treatment of these wastes is indirectly improved and, therefore, the production of biogas.

The cost of the ZY maXX XL 200 enzyme is $ 64.00 € / kg, and taking into account the small amounts of enzymes used in this experiment (100 µl / syringes per 0.350 mg of substrate evaluated or 0.01 L / 3.5 kg), an approximate cost of € 192 per ton of treated substrate can be inferred, demonstrating the economic feasibility of its use. In addition, the specific values of methane obtaining ​​would reach values ​​from a maximum of 0.047 CH4 / kg VS (mulatto pasture) to a minimum of 0.024 CH4 / kg VS (CT-115) increments, compared with the same substrates without pre-treatments.

The results obtained regarding the evolution of the pH are shown in Figure 2

Regarding the evolution of the pH, in Figure 2, it was seen that the results obtained in the biomass evaluated, showed that all the substrates at the end of the anaerobic biodigestion cycle presented pH values above 7. Therefore, the enzyme ZY maXX XL 200 allows maintaining adequate conditions for a good degradation activity of the substrates in the pH ranges between 6 and 8, which agrees with the results raised by Vintiloiu et al. (2009).

Table 3 shows a summary of the average values obtained in each substrate analyzed for biogas and methane yield, respectively, on laboratory scale.

From the analysis in Table 3, it was observed that the maximum values of the specific biogas yield were obtained in the mulatto pasture (0.485 m³ / kg VS). Meanwhile, the minimum value was obtained with natural pasture (0.452 m³ / kg VS). Similarly, the maximum specific yield values of methane were observed with the mulatto pasture (0.268 m³ CH₄ / kg VS) and the minimum values obtained coincided with the natural pasture (0.254 m³ CH₄ / kg VS). These results achieved on the laboratory level differ from those obtained by Martinez et al. (2014), which studied other biomass valued without the addition of enzymes on laboratory scale; as well as from those obtained by Martínez et al. (2015), where they used a chemical-thermal pre-treatment for those same substrates.

The results of the statistical analysis of the specific methane yield variable (m³ CH₄ / kg VS) in the evaluated treatments are presented in Figure 3.

From the analysis of Figure 3, it was observed that the highest values of the specific yield of methane (m³ CH₄ / kg VS), are obtained with the substrates treated with enzymes with respect to the reference substrate (Standard Hay) presenting significant differences with respect to substrates not treated with enzymes with the exception of CT-115.

La mayoría de las fuentes bibliográficas reportan que las diferencias en la cinética, potencial y rendimiento del metano están en dependencia del tipo de sustrato utilizado (Forster et al., 2012). Los métodos de pre tratamientos de los sustratos tienen como objeto el mejoramiento de las cualidades del proceso de digestión anaeróbica de estos, al alterar sus propiedades físicas, químicas y biológicas, mejorarando la disponibilidad de los componentes de los sustratos para incrementar el proceso de hidrólisis en la digestión anaerobia, el cual es la etapa limitante de los sustratos lignocelulósicos. Existen diferentes tipos de pre-tratamientos utilizados en los sustratos, los cuales se pueden clasificar en básicos y especiales. Dentro de los básicos están aquellos que tienen la finalidad en disminuir el tamaño de las partículas (trituración, molinado, tamizado). Dentro de los especiales se pueden mencionar (tratamientos térmicos, químicos, utilización de ultrasonido, radiación por microondas y los biológicos (utilización de enzimas, hongos y bacterias).

Sin embargo, estos muestran ciertas particularidades, tales como: incremento de los costos de manipulación, aumento de los requisitos legislativos para la estabilización y la remoción de posibles patógenos dañinos, tendencia al manejo de menores límites de nitrógeno, lo cual permite el manejo de la edad de estos sustratos, y el crecimiento de la biodegradabilidad de sustratos activados (Zhong et al., 2011). No obstante, se hace necesario un análisis de los pre- tratamientos a utilizar en dependencia del tipo, actuación y costos.

Pre- tratamientos biológicos: el objetivo de éstos es preparar a los sustratos para la degradación enzimática; no obstante, el mejor método y condición de pre- tratamiento depende en gran medida del tipo de sustrato a usar. Entre los microorganismos más utilizados para degradar sustratos orgánicos se encuentran varios tipos de hongos, tales como: carmelita, blanco y suaves putrefactos, además de algunos tipos de bacterias Kurakake et al. (2007). Taherzadeh y Karimi (2008), estudiaron el efecto de pre-tratamientos biológicos en papel de oficina con dos cadenas de bacterias (Sphingomonas paucimobiles y Baccilus circulans), obteniendo mejoras en la hidrólisis enzimática, así como un 94% de recuperación del azúcar. Dependiendo del tipo de sustrato a pre- tratar (residuos de casas, aguas residuales, residuos de destilería, etc.), la hidrólisis enzimática puede realizarse mediante diferentes tipos de hongos o combinaciones de estos (Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, etc). Taniguchi et al. (2005), evaluaron el efecto de varios pre- tratamientos biológicos en la paja de arroz usando 4 hongos blancos putrefactos (Phanerochaete chrysospurium, Tramete versicolor, Ceriporiopsis subvermispora y Pleurotus ostreatus). El pre- tratamiento con Pleurotus ostreatus resultó en una degradación selectiva de la lignina y un incremento de la susceptibilidad de la paja de arroz a ser hidrolizada enzimáticamente. También, en la fase de fermentación sólida de la cáscara de naranja con cadenas de hongos del tipo Sporotrichum, Aspergillus, Fusarium y Penicillum, se mejoró la capacidad de alimentación de constituyentes y se redujo el nivel de sustancias antimicrobianas. En un trabajo similar, realizado por Taherzadeh y Karimi (2008), fueron usados cultivos de hongo blanco-suaves para descontaminar las aguas residuales del molinado de olivas, mejorando el proceso de digestión anaerobia. Vintiloiu et al. (2009), investigaron la influencia de la temperatura y el pH de varias enzimas comerciales sobre la degradación de mazorcas y paja de maíz. Según esos autores, los mejores efectos se obtuvieron a valores de temperatura de 50 ºC y las mejores potencialidades de hidrólisis a valores de pH entre 4 y 6. Sin embargo, como la metanogénesis del proceso anaerobio tiene lugar a valores entre 6 y 8, los autores concluyeron que habría que buscar una enzima que mantenga una adecuada actividad en estos rangos de pH.

El bajo requerimiento energético, el no uso de compuestos químicos y la apacible condición ambiental son las principales ventajas de los pre-tratamientos biológicos. Sin embargo, a veces la eficiencia de estos pre-tratamientos es baja. Por tal motivo, los pre- tratamientos biológicos comúnmente requieren de un pre- tratamiento previo mediante la aplicación de métodos físicos, químicos o termo-químicos.

Martínez et al. (2015), publicaron un trabajo utilizando un pre tratamiento termo-químico en algunas de las biomasas que se valoran en esta investigación. Por lo que el presente trabajo constituye una continuación de la investigación en la que se aplican pre- tratamientos biológicos para aplicar la digestión anaerobia de residuos agrícolas y de cantina, los cuales se han soportado en investigaciones de Martinez et al. (2015); Martínez y García (2016); así como en otros trabajos anteriores (Martinez et al., 2014).

Del análisis de estas fuentes bibliográficas se puede apreciar que la aplicación de un pre- tratamiento con enzimas a residuos orgánicos de tipo lignocelulósicos, resultaría muy adecuado para favorecer la biodegradabilidad y la producción de metano. Por tanto, el objetivo de esta investigación consiste en aplicar un pre- tratamiento con enzimas a diferentes tipos de biomasas agrícolas, estudiando su efecto sobre la producción de metano.

Este trabajo fue realizado en la Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas, pero el material de investigación (Liquid cellulase enzymatic preparation, ZY maXX XL 200) fue donado por la Empresa BIOPRACT GmbH, a través de investigadores de la Universidad de Hohenheim, Alemania. El experimento fue ejecutado durante el período comprendido desde septiembre 2017 hasta noviembre 2018. Para su desarrollo se consultaron diferentes normas vigentes para este tipo de investigación, según se indica a continuación.

Los sustratos se caracterizaron de acuerdo con la norma VDI (2006) y siguiendo la caracterización y clasificación general de sustratos, se pudo estimar las posibilidades de fermentabilidad de los materiales orgánicos. En este trabajo fueron estudiados tres residuos agrícolas con alto contenido de compuestos lignocelulósicos: pasto natural, pasto variedad mulato y pasto variedad CT-115. Las muestras fueron recolectadas considerando sus raíces, tallos, hojas y frutos. Estos residuos fueron secados y fraccionados en partículas de 1 mm de tamaño, tomando muestras para realizar las investigaciones a escala de laboratorio en Alemania y a escala de campo en Cuba. Las investigaciones en Alemania fueron ejecutadas entre los meses de septiembre y noviembre 2017, se utilizó un tratamiento con enzimas y se investigó adicionando un inóculo vacuno. En Cuba fueron replicadas estas investigaciones experimentales a escala de campo. A las muestras experimentales se les aplicó un pre-tratamiento con enzimas, donde fue añadida la enzima ZY maXX XL 200 en dosis de 100 µl/jeringas por 350 mg de sustrato a valorar. Los sustratos inoculados con la enzima se dejaron reposar durante 4 horas; posteriormente, se le añadió el inóculo (30 mL del efluente porcino de un biodigestor anaerobio). A continuación, los sustratos pre-tratados, más el inóculo adicionado, fueron introducidos en jeringas experimentales de 100 mL de capacidad. El experimento tuvo una duración de 35 días, para observar el comportamiento de la digestión anaerobia durante este ciclo. En Alemania se utilizó un inóculo vacuno; mientras, en Cuba se utilizó un inóculo porcino procedente de biodigestores en producción. En ambos casos, en las jeringas experimentales se colocó un aditamento denominado Hohenheim Bench Test (HBT), el cual consiste en un dispositivo capaz de soportar simultáneamente 149 jeringas experimentales, colocadas horizontalmente y rotando durante toda la fase de investigación. Este dispositivo fue ubicado dentro de una incubadora a una temperatura constante de 35 ^oC. Cada variante experimental fue evaluada a razón de tres réplicas por cada sustrato, así como una réplica en contenedores plásticos (pomo plástico), con el objeto de investigar la evolución del pH y la producción de metano en el proceso de digestión anaerobia en condiciones de campo. Fueron objeto de estudio los siguientes parámetros:

A partir de los datos de entrada, mediante el uso softwares elaborados para estos fines (Gärtest nach VDI 4630) y siguiendo la norma VDI (2006), se procedió a calcular los siguientes parámetros:

En la Tabla 1 se muestra las condiciones de ensayo en cada biomasa objeto de investigación.

En la Figura 1 se observa la evolución del rendimiento específico de producción de metano en todos los sustratos evaluados con la adición de enzimas y sin esta. El mayor valor se obtuvo con el sustrato pasto mulato (0,268±0,011 m³ CH₄/kg VS), seguidos del pasto variedad CT-115 (0,258±0,018 m³ CH₄/kg VS) y culminando con el pasto natural (0,254±0,023 m³ CH₄/kg VS). Se observaron los incrementos superiores en todos los sustratos donde se aplicó el pre-tratamiento con enzimas con respectos a las combinaciones donde no fue aplicado el referido pre-tratamiento; no obstante, los valores obtenidos están por debajo a los obtenidos por Martinez et al. (2014). Este resultado pudiera estar dado por el menor potencial de metano de estas biomasas; además, de por la utilización de raíces, hojas, tallos y frutos mezclados de estas biomasas agrícolas, las cuales poseen mayor cantidad de fibra (celulosa y hemicelulosa) comparado con los estudios efectuados anteriormente de otras biomasas en solitario.

En la Tabla 2, se presentan los resultados obtenidos con los sustratos valorados con y sin el tratamiento con enzimas.

En la Tabla 2, se pudo apreciar que, de los sustratos evaluados: pasto variedad CT-115 (toda la planta), pasto mulato (solamente hojas) y pasto natural (toda la planta), la acción del complejo de enzimas potencia la producción de metano. Sin embargo, al replicar estos experimentos a nivel de campo en Cuba, los resultados no fueron satisfactorios. En el caso de los experimentos efectuados en Cuba, se utilizó un inóculo porcino, pero quizás el factor limitante de los bajos rendimientos obtenidos por las biomasas investigada fue el tamaño de las partículas, las cuales no quedaron suficientemente trituradas, debido al desperfecto en el molino utilizado, lo cual pudo afectar la interacción de la enzima respecto a las biomasas utilizadas.

Según Brulé (2014), los experimentos en la etapa de hidrólisis enzimática muestran una baja eficiencia cuando son adicionadas enzimas a los sustratos agrícolas. El autor concluyó que la eficiencia de las enzimas puede ser favorecida por el bajo contenido de fibras recalcitrantes y la lignina, bajo pH y la temperatura. Además, refiere que, para lograr un efecto positivo de la adición de enzimas en la práctica productiva, los bioreactores anaerobios deben tener una alta carga orgánica (OLR), un bajo tiempo de residencia hidráulica (HRT) y los sustratos deben poseer una mezcla de cultivos energéticos. Por lo tanto, estos resultados están en contradicción con lo reportado por Brulé et al. (2011). Los resultados de esta investigación indican un efecto positivo con la adición de la enzima ZY maXX XL 200 a los sustratos evaluados, y cuando se utiliza una densidad de inóculo apropiada. Se debe destacar la potencialidad que posee la enzima ZY maXX XL 200 para favorecer el proceso de hidrólisis, la cual es la etapa limitante en la digestión anaerobia de estos tipos de residuos; al mejorarse le la hidrólisis, indirectamente se mejora el tratamiento anaerobio de estos residuos y, por ende, la producción de biogás.

El costo de la enzima ZY maXX XL 200 es de $ 64,00 €/kg, y teniendo en cuenta las pequeñas cantidades de enzimas utilizadas en este experimento (100 µl/jeringas por cada 0,350 mg de sustrato evaluado o 0,01 L/3,5 kg), se puede inferir un gasto aproximado de € 192 por tonelada de sustrato tratado, demostrando la factibilidad económica de su utilización. Además, los valores específicos de obtención de metano alcanzarían valores desde un máximo de 0,047 CH₄/kg VS (pasto mulato) hasta un mínimo de 0,024 CH₄/kg VS (CT-115), incrementos comparando con los mismos sustratos sin pre-tratamientos.

En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos respecto a la evolución del pH.

Respecto a la evolución del pH, en la Figura 2 se pudo apreciar que los resultados obtenidos en las biomasas evaluadas, mostraron que todos los sustratos al terminar el ciclo de biodigestión anaerobia presentaron valores de pH por encima de 7. Por tanto, la enzima ZY maXX XL 200 permite mantener condiciones adecuadas para una buena actividad degradadora de los sustratos en los rangos de pH entre 6 y 8, lo cual concuerda con lo planteado por Vintiloiu et al. (2009).

En la Tabla 3 se muestran un resumen de los valores promedios obtenidos en cada sustrato analizado para el rendimiento de biogás y metano, respectivamente a escala de laboratorio.

Del análisis de la Tabla 3, se observó que los valores máximos del rendimiento específico de biogás se obtuvieron en el pasto variedad mulato (0,485 m³/kg VS); mientras, el mínimo valor se obtuvo con el pasto natural (0,452 m³/kg VS). Similarmente, los valores máximos de rendimiento específico de metano se observaron con el pasto variedad mulato (0,268 m³ CH₄/kg VS) y los valores mínimos obtenidos coincidieron con el pasto natural (0,254 m³ CH₄/kg VS). Éstos resultados alcanzados a nivel de laboratorio difieren a los obtenidos por Martinez et al. (2014), los cuáles estudiaron otras biomasas valoradas sin la adición de enzimas a escala de laboratorio; así como a los obtenidos por Martínez et al. (2015), donde utilizaron un pre-tratamiento químico-térmico para esos mismas sustratos.

En la Figura 3 se presenta los resultados del análisis estadístico de la variable rendimiento específico de metano (m³ CH₄/kg VS) en los tratamientos evaluados.

Del análisis de la figura 3, se pudo observar que los valores más altos del rendimiento rendimiento específico de metano (m³ CH₄/kg VS), se obtienen con los sustratos tratados con enzimas respecto al sustrato referencia (Hay estándar) presentando diferencias significativas con respecto a los sustratos no tratados con enzimas con la excepción del CT-115.