Caracterización fitoquímica y actividad antioxidante de extractos de diferentes partes de Moringa oleifera

Material vegetal

El material vegetal que se utilizó (parte apical y hojas secas) de Moringa oleifera Lam. correspondió al ecotipo Criolla, cosechada en el mes de junio del año 2022 en la Unidad Productiva Finca “Futuro Lechero”, municipio Playa, perteneciente al Centro de Investigación de Plantas Proteicas y Productos Bionaturales, con ubicación geográfica 23° 04’ 20” N y 82° 29’ 20” E. Las semillas de este ecotipose encuentran conservadas en el Banco Nacional de Germoplasmas de la Unidad Básica Productiva “El Pitirre”, Los Palacios, Pinar del Río, perteneciente también al Centro de Investigaciones en Plantas Proteicas y Productos Bionaturales. Las partes de las semillas de Moringa oleifera Lam. evaluadas (cáscara de semilla y torta de semilla), correspondieron a semillas procedentes de la India en 2016, adquiridas para la producción de aceite en instalaciones del CIPB.

Obtención y caracterización cualitativa del extracto hidroalcohólico

A partir de cada parte de la planta de Moringa se prepararon los extractos hidroalcohólicos al 30 y al 70% (v/v) de etanol. Las muestras se molinaron a un tamiz de 2 mm para realizar la extracción por el método de maceración a una proporción de 1/10 y 1/30 (p/v) durante seis días a temperatura entre 25 y 28 ºC (Miranda & Cuellar, 2012Miranda, M., & Cuellar, A. (2012). Farmacognosia y Productos Naturales: Vol. Manual de Prácticas de Laboratorio (Manual de Prácticas de Laboratorio). Félix Varela, Universidad de La Habana.). Los extractos se filtraron por papel de filtro Whatman Nº 1 y se concentraron diez veces al vacío en un rotoevaporador Buchi modelo R-205, a temperatura menor de 50 °C. Los extractos se dispensaron en bulbos previamente identificados, a razón de 2 mL y se conservaron a temperatura -20 ºC.

Determinación de sólidos extraíbles totales

Para esto se tomó cápsulasdecerámicas vacías y se colocaron en una estufa (Binder, modelo ED-240), a 105 ºC durante una hora. Luego se ubicaron en una desecadora hasta su enfriamiento a temperatura ambiente. Seguidamente se pesaron en una balanza analítica (Kern, modelo 770), se añadió a cada cápsula 1 mL de los extractos y se pesaron nuevamente. Posteriormente se colocaron en baño de María (Ovan, modeloB112-DE), a temperatura 98 ºCy se evaporó las muestras hasta casi sequedad. Luego las muestras evaporadas se llevaron a una estufa a 105 ºC, durante 1h. Pasado el tiempo, se enfrió en la desecadora para su pesada final. La determinación se realizó por triplicado para cada extracto. Se calculó los sólidos extraíbles totales (SET) de la siguiente manera:

donde:

S: masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g);

V: masa de la cápsula vacía (g);

LL: masa de la cápsula con la muestra líquida (g).

Determinación del contenido de polifenoles totales

Se realizó por el método de Folin-Ciocalteu en medio básico (Farmacopea Británica 2014).La curva patrón donde se utilizó el ácido gálico (Merck) se preparó a una concentración de 0,5 mg/mL, a partir de la cual se realizaron diluciones para obtener concentraciones de 0,005 mg/mL y 0,050 mg/mL. Se tomaron 96 μL de cada concentración de los extractos, se mezclaron con 480 μL de agua destilada, 48 μL del reactivo ácido fosfomolíbdico-fosfotúngistico (Folin-Ciocalteu) y 576 μL de Na₂CO₃ 29% (p/v). Se utilizó como blanco agua destilada. La mezcla se incubó a temperatura ambiente, durante 30 minutos, protegida de la luz y se midió la absorbancia a 760 nm en espectrofotómetro (Shimadzu, modelo UV160-A). Los ensayos se realizaron por triplicado. El resultado se expresó como miligramos equivalentes de ácido gálico por gramos de extracto seco (mg EAG/g MS).

Determinación del contenido de flavonoides totales

Se determinó por el método colorimétrico del cloruro de aluminio (Woisky & Salatino, 1998Woisky, R., & Salatino, A. (1998). Analysis of propolis some parameters and procedures for chemical quality control. J Apic Res, 37, 99-105.). Se empleó como patrón de referencia la quercitina, a razón de 10 mg disueltos en etanol 80% (v/v) para preparar concentraciones de 0,025 mg/mL y 0,100 mg/mL. Se tomó 0,5 mL de cada muestra y se trató con 1,5 mL de etanol 95% (v/v), 0,1 mL de cloruro de aluminio (10% p/v), 0,1 mL de acetato de potasio (1 M) y 2,8 mL de agua destilada. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se leyó la absorbancia a 415 nm en espectrofotómetro (Shimadzu, modelo UV160-A). El contenido de flavonoides totales se expresó como miligramos equivalentes de quercitina por gramo de extracto seco (mg EQ/g MS). El ensayo se realizó por triplicado.

Determinación de la actividad antioxidante mediante el secuestro del DPPH

Se llevó a cabo mediante una modificación del método descrito por Tabart et al. (2009)Tabart, J., Kevers, C., Pincemail, J., Defraigne, J.-O., & Dommes, J. (2009). Comparative antioxidant capacities of phenolic compounds measured by various tests. Food chemistry, 113(4), 1226-1233. https://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.08.013 . Se prepararon cinco muestras con concentraciones diferentes de cada extracto a evaluar, de éstas se tomó 750 μL y se mezclaron con 1500 μL del reactivo DPPH (0,075 mg/mL). Como blanco se utilizó etanol 95% y como referencia 750 μL de etanol 95% más 1500 μL del reactivo DPPH. La reacción se dejó en la oscuridad durante 30 minutos y posteriormente se leyóla absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 517 nm en espectrofotómetro Shimadzu, modelo UV 1201. El porciento de inhibición se calculó mediante la fórmula siguiente:

donde:

Abs Control: Abs de etanol + DPPH;

Abs Muestra: Abs de extracto + DPPH.

Análisis estadísticos

Se usó el Microsoft Excel 2018 para calcular la media y su desviación estándar (DS) de las mediciones por triplicado (n=3). El procesamiento estadístico de la determinación de Polifenoles, flavonoide y DPPH se realizó mediante el programa SPSS para Windows versión 26.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Se llevó a cabo un análisis de varianza de clasificación simple a través de ANOVA, para un nivel de significación del 95% y para la comparación de las medias se utilizó el test de Rangos Múltiples de Duncan y Kruskal-Wallis de muestras no pareadas para comparación de los extractos, la significación estadística se consideró para p<0,05.

Sólidos extraíbles totales

Los resultados fitoquímicos de los extractos de las diferentes partes de Moringa oleifera se presentan en la Tabla 1. Los resultados obtenidos en el contenido de SET entre las proporciones de las partes de la planta utilizadas y los solventes no se comportaron de la misma manera.

Se pudo observar que los mayores valores se obtuvieron para los extractos de las hojas secas, mientras que los menores para la parte apical de la planta. El contenido de SET en la parte apical con proporción 1/10 se observó que aumentó a medida que se incrementó el etanol en la extracción. Igual mostró el extracto de hojas secas tanto para la proporción 1/10 como para 1/30. Sin embrago, en los casos de los extractos de cáscara y torta de semillas disminuyó la concentración de los SET con el incremento de la concentración del disolvente.

El contenido de sólidos totales brinda información sobre la cantidad de compuestos no volátiles presentes en un extracto determinado. La determinación de los SET resulta de gran importancia cuando de una planta se pretende extraer la mayor cantidad de metabolitos presentes en la misma. Los extractos obtenidos a partir de hojas de Moringa presentaron mayor cantidad de SET, lo que se traduce en una mayor presencia de metabolitos que pudieran presentar actividad antimicrobiana y específicamente ante cepas patógenas a peces.

Las desigualdades de los valores de SET en los extractos de distintas partes de la planta y la utilización del solvente a diferentes concentraciones sustentan de forma cuantitativa que las soluciones de solventes más polares son capaces de extraer una mayor cantidad de compuestos. Por otra parte, todos los extractos al disminuir la proporción del material vegetal/solvente se pudo observar que existió una disminución en el contenido de SET.

Mediante el análisis de varianza se pudo determinar que el contenido de SET presentó variaciones significativas (p<0,05) dependiendo de la proporción de material vegetal y del solvente utilizado.

Los resultados logrados son similares a los publicados por Owusu et al. (2011)Owusu, A. A. M., Achel, D. G., Adaboro, R. M., Asare, K. D., & Amoatey, M. H. (2011). Total phenolic content and antioxidant activity in leaf samples of twelve accessions of Moringa oleifera Lam. International Journal of Chemical and Analytical Science, 2(10), 1226-1230., quien planteó que las soluciones etanólicas presentan un mayor poder extractivo de sólidos extraíbles en Moringa oleifera. Es conocido que las disoluciones de etanol/agua ejercen notable influencia sobre la extracción de los compuestos fenólicos, fundamentalmente en comparación con los solventes monocomponentes. En un estudio realizado por Rojas et al. (2009)Rojas, H. N. M., Avellaneda, S. S., Cuéllar, A., Romeu, A. B., & L, M. D. (2009). Actividad antimicrobiana de Waltheria indica y Acacia farnesiana. Revista CENIC. Ciencias Biológicas, 40(2), 129-134. en plantas terrestres en México mostró que los solventes hidroalcohólicos son capaces de extraer un mayor porcentaje de sólidos que la extracción acuosa.

Cuantificación de metabolitos secundarios

Dentro del espectro de metabolitos secundarios presentes en las plantas, los compuestos fenólicos están involucrados directamente en la actividad biológica. Además de la selección del material vegetal y el disolvente de extracción con mayor potencialidad para el desarrollo de productos beneficiosos con actividad biológica para continuar su estudio.

Contenido de polifenoles totales

El contenido de polifenoles totales de los extractos hidroalcohólicos de las muestras estudiadas, se calculó a partir de la curva de calibración obtenida por regresión lineal del ácido gálico con su ecuación correspondiente: $y = \mathrm{0,9255}x + \mathrm{0,0267} \left(R2= \mathrm{0,997}\right).$

De acuerdo a los resultados obtenidos, el contenido de polifenoles totales de las muestras en estudio presentó valores entre 3,9 y 512,48 mg EAG/g MS (Tabla 1).

Para el caso del extracto etanólico 30% de torta de semilla se observó una disminución del rendimiento de extracción al disminuir la relación material vegetal/solvente. Sin embargo, el comportamiento en el resto de las extracciones etanólicas 30% de las distintas partes de la planta se observó con mayor rendimiento de extracción al disminuir la relación material vegetal/solvente. Esto concuerda con los principios de transferencia de masa, ya que implica un mayor gradiente de concentración entre el sólido y la mayor parte del líquido, lo que resulta en una mayor fuerza impulsora para la difusión de compuestos al disolvente (Carciochi et al., 2018Carciochi, A. R., Sologubik, A. C., Fernández, B. M., Manrique, O. D., & D’Alessandro, G. L. (2018). Extraction of antioxidant phenolic compounds from brewer’s spent grain: Optimization and kinetics modeling. Antioxidants, 7(4), 45. https://doi.org/10.3390/antiox7040045 ).

Con relación a las extraiones realizadas a mayor concentración de solvente (etanol 70%) se obtuvo una mejor cinética de extracción en la proporción 1/30 en los extractos de apical y un ligero aumento en el extracto de cáscara, con proporción 1/10. Por el contrario, existió una disminución en los extractos de apical, hojas y torta con proporción 1/10 y en los extractos de hojas y cáscara con proporción 1/30. Estos resultados coinciden con lo reportado por d’Alessandro et al. (2012)d’Alessandro, G. L., Kriaa, K., Nikov, I., & Dimitrov, K. (2012). Ultrasound assisted extraction of polyphenols from black chokeberry. Separation and purification technology, 93, 42-47. http://dx.doi.org/10.1016/j.seppur.2012.03.024 , quienes plantearon que el agua y las mezclas con baja concentración de etanol podrían acceder a las células, pero una alta concentración del mismo puede causar desnaturalización de las proteínas y evitar la disolución de polifenoles e influir en la extracción.

Mediante el análisis de varianza se pudo determinar que el contenido de polifenoles presentó variaciones significativas (p<0,05) y depende de la proporción de material vegetal y del solvente utilizado.

Al comparar la cuantificación de fenoles total en los extractos estudiados resultaron ser similares en las hojas secas, cáscara de semillas, inferior en la torta de semilla y superior en apical que los obtenidos por Campo et al. (2020)Campo, M., Cruz, C., Cunalata, G., & Matute, N. (2020). Infusiones de Moringa oleifera (moringa) combinada con Cymbopogoncitratus (hierba luisa) y Lippia alba (mastranto). Revista Ciencia UNEMI, 13(34), 114-126. I. en hojas secas, con valor de 21,27 mg EAG/g MS.

Los valores de polifenoles en los extractos de hojas realizados en el presente estudio, que oscilaron entre 23,51 y 512,48 mg EAG/g MS se encuentran dentro de los rangos reportados por Yadav 2018Yadav, A. (2018). Effect of drying and blanching (steam and lye) on the phytochemicals composition of sitalchini (Moringa oleifera) leaves and its sensory attributes [Tesis de pregrado]. Central Campus of Technology Institute of Science and Technology Tribhuvan University, Department of Food Technology.; Xu et al. 2019), quienes señalaron una concentración de 165,54 y 192,36 mg EAG/g MS, respectivamente, e inferiores al determinado por Shanmugavel et al. (2018)Shanmugavel, G., Prabakaran, K., & George, B. (2018). Evaluation of phytochemical constituents of Moringa oleifera (Lam.) leaves collected from Puducherry region, South India. Int. J. Zool. Appl. Biosci, 3(1), 1-8. https://doi.org/10.5281/zenodo.1312977 en extracto etanólico de hojas secas con valor de 627,12 EAG/g MS.

En comparación de los valores de polifenoles en los extractos realizados en el presente estudio en semillas, con valores mínimo y máximo de 3,9 y 39,43 mg EAG/g MS, respectivamente, con otros estudios, se observó que se encuentran por debajo de los informados por Ccasa y Castillo, (2013)Ccasa, J., & Castillo, R. (2013). Aislado proteico y efecto antioxidante del extracto de la Moringa (Moringa oleifera Lam) para la elaboración de una bebida funcional. [Tesis de pregrado]. Universidad Nacional del Altiplano, Facultad de Ciencias Agrarias.; Guzmán et al. (2020)Guzmán, M. S. H., López, M. M. J., Madera, S. T. J., Núñez, C. C. A., Grijalva, V. V. C. P., Villa-Lerma, L. A. G., & Rodríguez, N. J. R. (2020). Nutritional characterization of Moringa oleifera leaves, seeds, husks and flowers from two regions of Mexico. Agronomía Colombiana, 38(2), 287-297. https://doi.org/.http://doi.org/10.15446/agron.colomb.v38n2.82644 , con valores de 160,87 y 212,973 mg EAG/g MS, respectivamente. Sin embargo, coinciden con los informados por Reyes et al. (2021)Reyes, M., Angulo, C., & Pérez, J. J. M. (2021). Antibacterial and immunomodulatory activity of moringa (Moringa oleifera) seed extract in Longfin yellowtail (Seriola rivoliana) peripheral blood leukocytes. Aquaculture Research, 52(9), 4076-4085. https://doi.org/10.1111/are.15245 de 9,38 mg EAG/g MS, que están dentro del rango obtenido en este estudio.

Contenido de flavonoides totales

El contenido de flavonoides totales de los extractos hidroalcohólicos de las muestras estudiadas, se calculó a partir de la curva de calibración obtenida por regresión lineal de la quercitina con su ecuación correspondiente: $y = \mathrm{2,7061}x + \mathrm{0,0228} \left(R2= \mathrm{0,993}\right).$

Con respecto al contenido de flavonoides totales de las muestras estudiadas (Tabla 1) presentaron valores entre 0,7 y 56,86 mg EQ/g MS.

Con respecto al contenido de los flavonoides en los extractos de hojas, los resultados del presente trabajo oscilaron entre 0,7 y 56,86 mg EQ/g MS, superiores a los encontrados por Moyo et al. (2012)Moyo, B., Oyedemi, S., Masika, P., & Muchenje, V. (2012). Polyphenolic content and antioxidant properties of Moringa oleifera leaf extracts and enzymatic activity of liver from goats supplemented with Moringa oleifera leaves/sunflower seed cake. Meat science, 91(4), 441-447. https://doi.org/10.1016/j.meatsci.2012.02.029 ; Shanmugavel et al. (2018)Shanmugavel, G., Prabakaran, K., & George, B. (2018). Evaluation of phytochemical constituents of Moringa oleifera (Lam.) leaves collected from Puducherry region, South India. Int. J. Zool. Appl. Biosci, 3(1), 1-8. https://doi.org/10.5281/zenodo.1312977 ; Befa et al. 2020Befa, A., Gebre, A., & Bekele, T. (2020). Evaluation of nutritional properties of dried Moringa (Moringa stenopetala) leaves and dried Moringa leaves infusion. Med Aromat Plants (Los Angeles), 9(363), 2167-0412.), con valores de 22,16; 45,1y 11,9 mg EQ/g MS, respectivamente e inferiores a los obtenidos por los autores Yadav (2018)Yadav, A. (2018). Effect of drying and blanching (steam and lye) on the phytochemicals composition of sitalchini (Moringa oleifera) leaves and its sensory attributes [Tesis de pregrado]. Central Campus of Technology Institute of Science and Technology Tribhuvan University, Department of Food Technology.; Xu et al. (2019) y Guzmán- et al. (2020)Guzmán, M. S. H., López, M. M. J., Madera, S. T. J., Núñez, C. C. A., Grijalva, V. V. C. P., Villa-Lerma, L. A. G., & Rodríguez, N. J. R. (2020). Nutritional characterization of Moringa oleifera leaves, seeds, husks and flowers from two regions of Mexico. Agronomía Colombiana, 38(2), 287-297. https://doi.org/.http://doi.org/10.15446/agron.colomb.v38n2.82644 con valores de 558, 63; 192,36 y 1427,27 EQ/g MS, respectivamente. El valor de flavonoides en los extractos de semillas varió de 3,39 a 39,43 mg EQ/g MS, superior al informado por Reyes et al. (2021)Reyes, M., Angulo, C., & Pérez, J. J. M. (2021). Antibacterial and immunomodulatory activity of moringa (Moringa oleifera) seed extract in Longfin yellowtail (Seriola rivoliana) peripheral blood leukocytes. Aquaculture Research, 52(9), 4076-4085. https://doi.org/10.1111/are.15245 , de 2,40±1,3 mg EQ/g MS) e inferior al determinado por Guzmán et al. (2020)Guzmán, M. S. H., López, M. M. J., Madera, S. T. J., Núñez, C. C. A., Grijalva, V. V. C. P., Villa-Lerma, L. A. G., & Rodríguez, N. J. R. (2020). Nutritional characterization of Moringa oleifera leaves, seeds, husks and flowers from two regions of Mexico. Agronomía Colombiana, 38(2), 287-297. https://doi.org/.http://doi.org/10.15446/agron.colomb.v38n2.82644 , con valor de 249,86 mg EQ/g MS. Por último, el contenido flavonoides en los extractos de cáscara se mostró en el rango de 3,93 y 32,76mg EQ/g MS), muy inferior al determinado en el estudio realizado por Guzmán et al. (2020)Guzmán, M. S. H., López, M. M. J., Madera, S. T. J., Núñez, C. C. A., Grijalva, V. V. C. P., Villa-Lerma, L. A. G., & Rodríguez, N. J. R. (2020). Nutritional characterization of Moringa oleifera leaves, seeds, husks and flowers from two regions of Mexico. Agronomía Colombiana, 38(2), 287-297. https://doi.org/.http://doi.org/10.15446/agron.colomb.v38n2.82644 , con valor de 202,81 mg EQ/g MS.

Mediante el análisis de varianza se pudo determinar que el contenido de flavonoides presentó diferencias significativas (p<0,05), en los extractos realizados en el presente estudio, en dependencia de la proporción de material vegetal y del solvente utilizado.

Aunque la producción de compuestos activos en plantas medicinales está guiada por procesos genéticos, también está fuertemente influenciada por factores ambientales, los cuales causan cambios en el crecimiento de las plantas, así como la cantidad y calidad de sus metabolitos. Factores como la temperatura, régimen de precipitaciones, el aire, la disponibilidad de nutrientes del suelo en el momento de la colecta, la iluminación, pueden tener un impacto importante sobre la concentración de metabolitos secundarios (Yuan et al., 2020Yuan, Y., Tang, X., Jia, Z., Li, C., Ma, J., & Zhang, J. (2020). The effects of ecological factors on the main medicinal components of Dendrobium officinale under different cultivation modes. Forests, 11(1), 94. https://doi.org/10.3390/f11010094 ).

Determinación de la actividad secuestradora del radical DPPH

Desde el punto de vista cualitativo en el ensayo se detectó la variación en la coloración desde el color púrpura hasta el color amarillo (Figura 1). Esta variación se observó en todas las muestras evaluadas lo que demostró la presencia de sustancias que poseen la capacidad de atrapar los radicales libres que logran reducir el 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo con la concomitante pérdida de absorbancia en la solución.

Los porcientos de inhibición del DPPH para los extractos hidroalcohólicos estudiados presentaron valores entre 2,84% y 74,05%.

En la Figura 2 se muestran los resultados de los extractos de las cascara de semillas que presentaron los valores mayores de inhibición en 74,05% y alcanzó una concentración de 4 mg/mL. Los extractos de la torta de semilla fueron los que manifestaron menor inhibición con 2,84% y una concentración de 3 mg/mL. Mientras que los extractos de la apical y de hojas presentaron valores similares de inhibición.

Mediante el análisis de varianza se pudo determinar que la actividad antioxidante secuestradora del radical DPPH en los extractos del presente trabajo presentó variaciones significativas (p<0,05) y mostró dependencia entra las proporciones del material vegetal y del solvente utilizados.

Este método del radical DPPH presenta también la ventaja de ser una prueba no enzimática y es utilizado para proveer información básica en la reactividad de compuestos para el secuestro de radicales (Silva et al., 2000Silva, F. A., Borges, F., Guimarães, C., Lima, J. L., Matos, C., & Reis, S. (2000). Phenolic acids and derivatives: Studies on the relationship among structure, radical scavenging activity, and physicochemical parameters. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(6), 2122-2126. https://doi.org/10.1021/jf9913110 ).

Se tiene evidencia que Moringa en los alimentos es apta para fines nutricionales, además de la prevención de enfermedades y uso como fuente antioxidante. Recientemente se identificó la propiedad antioxidante de proteínas de extractos de hojas frescas de Moringa y de harina de Moringa comercial mediante los métodos de FRAP y DPPH, que muestran proteínas antioxidantes de la hoja de Moringa especialmente de potencial interés, porque el estrés oxidativo está altamente relacionado con enfermedades crónicas como la diabetes y sus complicaciones (Kurniawan, 2021Kurniawan, Y. S. (2021). A comparative study on phytochemical screening and antioxidant activity of aqueous extract from various parts of moringa oleifera. Indonesian Journal of Natural Pigments, 3(2), 43-47.).